Team K07-2014: Panagiota Michalaki, Polonifis Thanasis, Varvara Tsatsou, Tochnitis Michalis Students, Dept of Mechanical Eng, NTUA
Short Abstract Σκοπός του συγκεκριμένου θέματος είναι η κατασκευή ενός αυτόματου μονοαξονικού συστήματος μέτρησης πρωτεϊνών με 3D-printer.
Acknowledgements Ευχαριστούμε θερμά τον Νίκο Καβαλόπουλο για την πολύτιμη βοήθειά του και την καθοδήγησή του στην προσπάθειά μας.
ΕισαγωγήΗ διαδικασία ELISA (Enzymed-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) είναι ένα τεστ που χρησιμοποιεί αντισώματα και αλλαγή χρώματος για την ανίχνευση μιας ουσίας. Με την κατασκευή που θέλουμε να αναπτύξουμε δίνεται η δυνατότητα να πραγματοποιηθεί όλη η διαδικασία του πειράματος (και τα 7 στάδια) σε έναν μόνο άξονα (άξονας z) εξού και η ονομασία του θέματος που αναλάβαμε. Επομένως η κατασκευή αφορά ένα σταθερό σύστημα από εφτά 96άρες πλάκες (multiwell plate) τοποθετημένες η μία κάτω από την άλλη. Θα δίνεται έτσι η δυνατότητα στον βιολόγο να επεξεργάζεται πολλαπλά δείγματα χωρίς να χρειάζεται να αλλάζει πλάκες, τρυπώντας στο κάθετο επίπεδο για να φτάσει στην επόμενη φάση του τέστ. Λίγα λόγια για την μέδοδο ElisaΑποφασίσαμε να μην επεκταθούμε ιδιαίτερα στην ανάλυση του Elisa(παλιότεροι ή παρεμφερείς μέθοδοι, πλεονεκτήματα-μειονεκτήματα κ.α)αφού υπάρχουν ήδη αρκετές αναφορές στη σελίδα του μαθήματος. Θα αρκεστούμε στα κύρια σημεία του θέματος, που θα παρουσιάσουμε συνοπτικά, ώστε να υπάρχει μια λογική σειρά. ¬Τι είναι το Elisa;Πρόκειται για ένα τεστ που χρησιμοποιεί αντισώματα και αλλαγή χρώματος για να ανιχνεύσει μια ουσία. Πιο ειδικά είναι μια βιοχημική τεχνική με την οποία μπορούμε να αξιολογήσουμε είτε την παρουσία ενός αντιγόνου είτε την παρουσία ενός αντισώματος σε ένα δείγμα.
Οι τεχνικές του Elisa μπορεί να χρησιμοποιηθούν: → είτε για ποιοτική ανάλυση (θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα δηλαδή αν το δείγμα μας έχει τελικά χρωματιστεί ή όχι).
→ είτε για ποσοτική ανάλυση (πόσο έντονα χρωματισμένο είναι το δείγμα μας κάτι που έχει να κάνει με την μέτρηση τηςαπορρόφησης του δείγματος και την σύγκρισή του με κάποια πρότυπη καμπύλη προκειμένου να προσδιοριστεί ηποσοτική συγκέντρωση του αντιγόνου ή του αντισώματος).
¬ Που χρησιμοποιείται;
Ιατρική → κυρίως στην Aνοσολογία, Αλλεργιολογία και στην εργαστηριακή Ιατρική γενικότερα για την ανίχνευση διαφόρων ιών όπως ηπατίτιδα Α/Β/C, σύφιλη, έρπητας, HIV (AIDS) κ.τ.λ
Βιομηχανία → για τον εντοπισμό δυνητικά αλλεργιογόνων τροφών Τροφίμων (όπως είναι το γάλα, οι ξηροί καρποί, τα αυγά κ.τ.λ)
Τοξικολογία → σαν μια ταχεία προκαταρκτική διάγνωση για ορισμένες κατηγορίες φαρμάκων και ναρκωτικών
Τροφική → διαπιστώνεται ο βαθμός αντίδρασης, για κάθε τρόφιμο Δυσανεξία ξεχωριστά, καθώς επίσης και η διαφοροποίηση της δυσανεξίας σε μία μελλοντική εξέταση (η εγκυρότητα του εν λόγω τεστ είναι αμφιλεγόμενη).
¬Ποιες μέθοδοι υπάρχουν;→ Ανταγωνιστική μέθοδος (ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το αντιγόνο)→ Μη ανταγωνιστική μέθοδος (ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το αντίσωμα - τεχνική «sandwich»)
Αντίσωμα [1]
¬Σύντομη ορολογία που θα χρησιμοποιηθεί. Αντισώμα[1]: Είναιμια μεγάλη πρωτεΐνη σε σχήμα Υ και χρησιμοποιείται από το ανοσοποιητικό σύστημα για να εντοπίζει και να εξουδετερώνει ξένα αντικείμενα όπως τα βακτήρια και οι ιοί. Το αντίσωμα αναγνωρίζει ένα μοναδικό κομμάτι του εισβολέα που ονομάζεται αντιγόνο. Κάθε άκρο του «Υ» ατισώματος μπορεί να αναγνωρίσει και να συνδεθεί με ένα μέρος του εισβολέα αντιγόνου με μοναδική ακρίβεια. Κάτι σαν τον συνδυασμό κλειδιού και κλειδαριάς.
Αντιγόνο [1]
Αντιγόνο[1]: Είναι ένα οποιοδήποτε μόριο το οποίο μπορεί να δεσμεύεται ειδικά σε ένα αντίσωμα. Το όνομά του προκύπτει από την ικανότητά του να παράγει αντισώματα (όταν ένας οργανισμός αντιληφθεί την παρουσία αντιγόνου, πολλαπλασιάζεται για να το εξουδετερώσει).
Beads[2]: Πρόκειται για μαγνητικά μικροσφαιρίδια τα οποία επισημαίνονταιμε φθορίζουσες χρωστικές ουσίες, που παράγουν ένα ευρύ φάσμα χρωμάτων, και τα οποία χρησιμοποιούνται ως επιφάνεια πρόσδεσης-δέσμευσης του αντιγόνου. Τα σφαιρίδια αυτά δεν είναι ορατά με γυμνό μάτι γι’ αυτό έχουν
μαγνητικές ιδιότητες ώστε να μπορούμε να τα χειριζόμαστε.
Multiwell plate [3]
Μultiwell plate[3]: Πρόκειται για μια επίπεδη πλάκα μικροτιτλοδότησης όπως αποκαλείται (ή αλλιώς 96άρα πλάκα-αυτή που θα χρησιμοποιήσουμε εμείς), αφού διαθέτει πολλαπλά βοθρία-πηγαδάκια-wells, τα οποία επισημαίνονται με αριθμούς σε κάθε στήλη και με γράμματα σε κάθε σειρά για να μπορούμε να ταυτοποιούμε το συγκεκριμένο δείγμα. Σε αυτά τα πηγαδάκια οι βιολόγοι τοποθετούν το δείγμα τους.
Μικροπιπέτα [4]
Μικροπιπέτα[4]: Η μικροπιπέτα ή αλλιώς σιφώνιο χρησιμοποιείται για την μεταφορά και μέτρηση ενός όγκου υγρού. Μπορεί να μας δώσει ακρίβεια και σταθερότητα ακόμα και σε πολύ μικρές ποσότητες υγρού, της τάξης των μl.
¬Τι στάδια περιλαμβάνει η τεχνική «sandwich» με την οποία ασχολούμαστε;
Μέθοδος "sandwich"[5]
1. Προσθήκη αντισωμάτων σε μορφή μικροσφαιριδίων (beads) στο δείγμα. 2. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε από το αντίσωμα. 3. Προσθήκη δευτερεύοντος αντισώματος (δημιουργία sandwich). 4. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε από το δευτερεύον αντίσωμα. 5. Προσθήκη φθορίζουσας ουσίας (φυκοερυθρίνη). 6. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε. 7. Εναπόθεση των μικροσφαιριδίων (με ότι πλέον έχει προσκολληθεί πάνω τους ) σε μια καινούργια 96άρα πλάκα προκειμένου να τοποθετηθεί σε ειδικό φασματοφωτόμετρο και να μετρηθεί η απορρόφηση του δείγματος.
Ακολουθούν δύο βίντεο στα οποία φαίνονται παραστατικά οι τεχνικές elisa:
ΠρόβλημαΣτην πραγματικότητα για να πραγματοποιηθεί η επεξεργασία δείγματος με την μέθοδο elisa, με τον κλασσικό παραδοσιακό τρόπο, χρειάζονται πολλές 96άρες πλάκες για την επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων. Ο βιολόγος θα πρέπει κάθε φορά που θέλει να εφαρμόσει elisa να αλλάζει διαρκώς πλάκες. Αυτό απαιτεί χρόνο, υπομονή και σταθερότητα από την πλευρά των βιολόγων. ¬Τι στοχεύουμε να κάνουμε εμείς με αυτό το project;
Αυτό που εμείς στοχεύουμε να κάνουμε είναι να πραγματοποιείται όλη η διαδικασία του elisa δηλαδή και τα 7 στάδια χωρίς την απαίτηση διαρκούς αλλαγής πλακών επεξεργάζοντας ταυτόχρονα πολλαπλά δείγματα. Σκοπός μας είναι να κατασκευάσουμε ένα σταθερό σύστημα (χωρίς να υπάρχουν μεγάλα περιθώρια ανοχής από πλάκα σε πλάκα) από εφτά 96άρες πλάκες (μία για κάθε στάδιο) τοποθετημένες η μία κάτω από την άλλη για να πραγματοποιείται η μέθοδος στον κατακόρυφο άξονα z. Θέλουμε δηλαδή να δημιουργήσουμε με αυτόν τον τρόπο ένα 7-όροφο σύστημα πλακών που ανά πάσα στιγμή θα μπορεί να μετατραπεί σε 7 ξεχωριστές πλάκες.
¬Λεκτική περιγραφή της διαδικασίας που θέλουμε να επιτύχουμεΣημείωση:Στην διαδικασία που θα περιγράψουμε δεν θα σταθούμε στην χρήση της πιπέτας καθότι αυτό το κομμάτι αφορά μελλοντικά σχέδιά μας όπως αναφέρεται και παρακάτω.
Αρχικά τοποθετούμε το δείγμα μας στο well του 1ου ορόφου και προσθέτουμε τα αντισώματα σε μορφή μικροσφαιριδίων (beads).
Αναρροφάται με την πιπέτα η παραπάνω ποσότητα, αφού πρώτα έχει γίνει η επώαση (αδειάζοντας έτσι το well) και εγκλωβίζονται σε αυτήν τα beads λόγω της μαγνητικής τους ιδιότητας. Παράλληλα η ποσότητα που αναρροφήθηκε απορρίπτεται.
Απελευθερώνουμε τα beads στο well του 1ου ορόφου και ακολουθούμε την διαδικασία πλύσης.
Αναρροφούμε ξανά με την πιπέτα την παραπάνω ποσότητα (beads και απορρυπαντικό υγρό), εγκλωβίζουμε σε αυτήν τα beads και απορρίπτουμε το απορρυπαντικό.
Τρυπάμε με την ίδια πιπέτα το πάτωμα του 1ου ορόφου, κινούμενη στον κατακόρυφο άξονα (στην πιπέτα βρίσκονται ήδη εγκλωβισμένα τα μικροσφαιρίδια) ώστε να φτάσουμε στο well του 2ου ορόφου.
Εναποθέτουμε τα μικροσφαιρίδια, προσθέτουμε τα δευτερεύοντα αντισώματα και ακολουθούμε τα υπόλοιπα βήματα με την ίδια λογική που περιγράψαμε παραπάνω.
Τέλος αφού έχουμε τρυπήσει και το well του 6ου ορόφου απελευθερώνουμε τα μικροσφαιρίδια στο well του 7ου ορόφου. Μπορούμε πλέον να απομονώσουμε την έβδομη 96άρα πλάκα και να την τοποθετήσουμε στο Luminex, μια συσκευή που μετράει την φωτεινότητα που εκπέμπουν τα beads.
(Δεν πρέπει να ξεχνάμε ότι από την στιγμή που προσθέτουμε στο δείγμα μας τα beads το προς επεξεργασία υλικό δεν είναι πλέον το δείγμα, αλλά τα beads).Εννοείται πως όλη η παραπάνω διαδικασία αν πετύχει θα μπορεί να πραγματοποιηθεί με την βοήθεια πιπέτας πολλαπλών δειγμάτων, τοποθετώντας δείγματα και στα 96wells κάθε πλάκας.
Πρώτο “Brainstorming” Κατά την διαδικασία του πρώτου brainstorming στόχος μας ήταν να αναγνωρίσουμε τα κυριότερα προβλήματα που είχαμε να αντιμετωπίσουμε με τον σχεδιασμό της πλάκας καθώς και παρεμφερή εργαλεία (π.χ πιπέτα) που έπρεπε να χρησιμοποιηθούν. Από την διαδικασία προέκυψαν τα παρακάτω προβλήματα:
Υλικό με το οποίο θα δουλέψουμε: Το υλικό παίζει μεγάλο ρόλο αφού μεγάλη ψαθυρότητα θα οδηγούσε στην ανάγκη ανάπτυξης κατάλληλου σχεδίου που θα συγκρατούσε τυχόν θραύσματα που θα έπεφταν κατά το τρύπημα του κάθε πηγαδιού στο επόμενο.Κάτι τέτοιο θα ήταν ανεπιθύμητο για τους βιολόγους γιατί πιθανόν να επηρέαζε το αποτέλεσμα του τεστ.
Γεωμετρία και υλικό πιπέτας: Το μέγεθος της πιπέτας και ειδικότερα το μήκος της έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην κατασκευή μας καθώς μας περιόριζε σημαντικά στο συνολικό ύψος της κατασκευής αφού θα πρέπει να τρυπήσει μέχρι και 7 πλάκες. Περαιτέρω το υλικό της έπρεπε να μελετηθεί αν θα ήταν ικανό για να τρυπήσει το “πάτωμα” του κάθε well που θα δημιουργούσαμε. Σε αντίθετη περίπτωση θα έπρεπε να σχεδιάσουμε κατάλληλη πιπέτα η οποία θα μπορούσε όχι μόνο να τρυπήσει το “πάτωμά” μας αλλά και να εφαρμόζει κατάλληλα στο μηχάνημα του εργαστηρίου.
Έπειτα από συνάντηση με τους βιολόγους του εργαστηρίου καταλήξαμε στον τελικό όγκο του κάθε πηγαδιού και έτσι υπολογίσαμε και το ελάχιστο δυνατό ύψος της κάθε πλάκας (άρα και ολόκληρης της 7οροφης κατασκευής) και στην κατάλληλη επιλογή του μήκους της πιπέτας που θα πειραματιζόμασταν στο εργαστήριο. Επόμενο στάδιο του brainstorming και καθοριστικό ήταν η σχεδίαση του πατώματος του κάθε πηγαδιού το οποίο θα τρυπούσε η πιπέτα. Γνωρίζοντας ότι ο εκτυπωτής μας μπορούσε να τυπώσει ελάχιστο πάχος 100 μm, για λόγους σταθερότητας της κατασκευής, έπρεπε να επιλέξουμε κατάλληλη γεωμετρία ώστε η διάτρηση να γίνεται με τις παρακάτω ιδιότητες:
Εύκολα (χωρίς ιδιαίτερη προσπάθεια)
Με ακρίβεια
Με όσο δυνατό λιγότερα θραύσματα
Απλή γεωμετρία για εύκολη εκτύπωση στον 3D Printer
Όλα τα πατώματα είχαν κατά τον άξονα z ελάχιστο πάχος 100μm ώστε να είναι εύκολο να σπάσουν όταν τα πιέζει η πιπέττα.Μέτα από εκτύπωση στον 3d printer του εργαστηρίου ενώ ολοκληρώθηκε κανονικά η εκτύπωση τους,οι διατομές πάχους 100μm "εξαυλώθηκαν".Τότε αποφασίσαμε να αλλάξουμε το ελάχιστο πάχος από 100 σε 200μm και να επαναλάβουμε την εκτύπωση.
Μέσω της διαδικασίας προέκυψαν αρκετές ιδέες από τις οποίες κάποιες απορρίφθηκαν λόγω πολυπλοκότητας εκτύπωσης. Παρακάτω φαίνονται οι γεωμετρίες που προχώρησαν στην φάση του πειραματικού ελέγχου:
Πρώτο πείραμα Τα επικρατέστερα σχέδια, επτά στο σύνολο, εκτυπώθηκαν σε μορφή τετράγωνης πλάκας με την γεωμετρία του πατώματος στη μέση. Επιλέξαμε να εξετάσουμε τρείς πιπέτες διαφορετικών γεωμετριών με επικρατέστερη την δεύτερη πιπέτα όπως φαίνεται στην παρακάτω φωτογραφίσ: .
Το πείραμα εκτελέστηκε χειρονακτικά τοποθετώντας την κάθε πλάκα πάνω σε μια τυποποιημένη 96άρα πλάκα και χρησιμοποιώντας τα υλικά που υπάρχουν στην φωτογραφία που επισυνάπτουμε:
Σκοπός της πλάκας ήταν να στηρίξει το πάτωμά μας, προσομοιάζοντας έτσι μία 2όροφη κατασκευή (σαν να τρυπάμε το πάτωμα του προηγούμενου ορόφου και να καταλήγουμε στο επόμενο). Έτσι θα παρατηρούσαμε και τυχόν θραύσματα που θα είχαν περισυλλεχθεί στο πηγάδι.
Ακολουθούν δύο βίντεο με τις επιτυχημένες προσπάθειες του πειράματος:
Στο τέλος του πειράματος είχαμε τις εξής παρατηρήσεις:
Η πιπέτα 3 δεν ήταν η κατάλληλη για το σχέδιό μας λόγω υλικού διότι έσπαγε σε κάθε απόπειρα διάτρησης.
Επιτυχημένη θραύση είχαμε σε δύο συνολικά γεωμετρίες.
Η θραύση πάντα άφηνε πίσω της σημαντική ποσότητα υλικού στο πηγαδάκι.
Η μόνη γεωμετρία που ταίριαζε στις προϋποθέσεις που αναφέραμε πιο πάνω ήταν η (νουμερο)
Ειδικότερα μετά την επιλογή του κατάλληλου πατώματος προέκυψε και η ανάγκη επιλογής τρόπου για συγκράτηση των θραυσμάτων σε κάθε διάτρηση.
Φωτογραφίες αποτελεσμάτων πρώτου πειράματος:
Δεύτερο “brainstorming” Σε αυτή την διαδικασία στόχος μας ήταν η επίλυση του προβλήματος των θραυσμάτων που απέμεναν λόγω της διάτρησης. Αρχικά κινηθήκαμε κατασκευαστικά. Η σκέψη μας ήταν να φτιάξουμε μια “τσουλήθρα” κάτω από κάθε αντίστοιχο πηγάδι προκειμένου να κυλούν τα θράυσματα πάνω της και να συλλέγονται σε ένα σημείο. Κάτι τέτοιο ήταν αδύνατο καθώς δεν έιχαμε την πολυτέλεια του χώρου αφού εκατέρωθεν υπήρχαν και άλλα wells. Επικρατέστερη ιδέα υπήρξε η χρήση κολλητικής ταινίας (μονής όψεως) η οποία θα “σκέπαζε” την 96άρα πλάκα μας και θα παραλάμβανε τα θραύσματα (στο πρώτο επίπεδο προφανώς δεν υπήρχε τέτοια ανάγκη).
Δεύτερο πείραμα Στο πείραμα που ακολούθησε χρησιμοποιήσαμε δύο τέτοιες ταινίες, η μία τοποθετημένη στο πάτωμα του πρώτου επιπέδου και η δεύτερη στο χείλος του επόμενου επιπέδου.
Επιχειρήσαμε να τρυπήσουμε την ταινία αλλά αυτή ξεκολούσε. Παρόλα αυτά βγάλαμε το συμπέρασμα ότι η ταινία μπορούσε να συγκρατήσει τα θραύσματα.
Βίντεο δεύτερου πειράματος:
Έτσι καταλήξαμε στην τελική ιδέα της κολλητικής ταινίας διπλής όψεως την οποία θα τοποθετούσαμε στο χείλος κάθε πλάκας (πλην της πρώτης όπως προαναφέραμε). Με αυτό τον τρόπο θα καταφέρναμε δύο πράγματα, την σωστή εφαρμογή στην πλάκα (ώστε να μην ξεκολλάει) και την συγκράτηση των θραυσμάτων.
Από όλες τις παραπάνω διαδικασίες καταλήξαμε στα παρακάτω για κάθε μεμονωμένη πλάκα, για την ολοκληρωμένη 7όροφη κατασκευή καθώς και για την 7όροφη κατασκευή με ένα well που θα χρησιμοποιούσαμε στο τελικό πείραμα.
Design:
Μελλοντικά σχέδια Για περαιτέρω ανάπτυξη της διάταξης μας κρίνεται χρήσιμη η ανάπτυξη των παρακάτων ιδεών:
Η κατασκευή μιας ειδικής πιπέτας η οποία θα έχει την δυνατότητα για συγκράτηση των μικροσφαιριδίων (beads) καθώς και δύο διαφορετικά κανάλια για την αναρρόφηση των περιεχομένων του κάθε well και την απόρριψη των αποβλήτων. Η πιπέτα αυτή μπορεί να έχει και διαφορετικό υλικό για ευκολότερη διάτρηση (π.χ μέταλλο).
Αλλαγή γεωμετρίας των well ώστε το πάτωμά τους να έχει σχήμα U ή V με σκοπό να αποφευχθεί η πιθανότητα παραμονής υπολειμμάτων υγρού στις γωνίες του πηγαδιού.
Date:November-2014
Team K07-2014: Panagiota Michalaki, Polonifis Thanasis, Varvara Tsatsou, Tochnitis Michalis
Students, Dept of Mechanical Eng, NTUA
Short Abstract
Σκοπός του συγκεκριμένου θέματος είναι η κατασκευή ενός αυτόματου μονοαξονικού συστήματος μέτρησης πρωτεϊνών με 3D-printer.
Acknowledgements
Ευχαριστούμε θερμά τον Νίκο Καβαλόπουλο για την πολύτιμη βοήθειά του και την καθοδήγησή του στην προσπάθειά μας.
ΕισαγωγήΗ διαδικασία ELISA (Enzymed-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) είναι ένα τεστ που χρησιμοποιεί αντισώματα και αλλαγή χρώματος για την ανίχνευση μιας ουσίας. Με την κατασκευή που θέλουμε να αναπτύξουμε δίνεται η δυνατότητα να πραγματοποιηθεί όλη η διαδικασία του πειράματος (και τα 7 στάδια) σε έναν μόνο άξονα (άξονας z) εξού και η ονομασία του θέματος που αναλάβαμε. Επομένως η κατασκευή αφορά ένα σταθερό σύστημα από εφτά 96άρες πλάκες (multiwell plate) τοποθετημένες η μία κάτω από την άλλη. Θα δίνεται έτσι η δυνατότητα στον βιολόγο να επεξεργάζεται πολλαπλά δείγματα χωρίς να χρειάζεται να αλλάζει πλάκες, τρυπώντας στο κάθετο επίπεδο για να φτάσει στην επόμενη φάση του τέστ.
Λίγα λόγια για την μέδοδο ElisaΑποφασίσαμε να μην επεκταθούμε ιδιαίτερα στην ανάλυση του Elisa(παλιότεροι ή παρεμφερείς μέθοδοι, πλεονεκτήματα-μειονεκτήματα κ.α)αφού υπάρχουν ήδη αρκετές αναφορές στη σελίδα του μαθήματος. Θα αρκεστούμε στα κύρια σημεία του θέματος, που θα παρουσιάσουμε συνοπτικά, ώστε να υπάρχει μια λογική σειρά.
¬Τι είναι το Elisa;Πρόκειται για ένα τεστ που χρησιμοποιεί αντισώματα και αλλαγή χρώματος για να ανιχνεύσει μια ουσία. Πιο ειδικά είναι μια βιοχημική τεχνική με την οποία μπορούμε να αξιολογήσουμε είτε την παρουσία ενός αντιγόνου είτε την παρουσία ενός αντισώματος σε ένα δείγμα.
Οι τεχνικές του Elisa μπορεί να χρησιμοποιηθούν:
→ είτε για ποιοτική ανάλυση (θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα δηλαδή αν το δείγμα μας έχει τελικά χρωματιστεί ή όχι).
→ είτε για ποσοτική ανάλυση (πόσο έντονα χρωματισμένο είναι το δείγμα μας κάτι που έχει να κάνει με την μέτρηση τηςαπορρόφησης του δείγματος και την σύγκρισή του με κάποια πρότυπη καμπύλη προκειμένου να προσδιοριστεί ηποσοτική συγκέντρωση του αντιγόνου ή του αντισώματος).
¬ Που χρησιμοποιείται;
¬Ποιες μέθοδοι υπάρχουν;→ Ανταγωνιστική μέθοδος (ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το αντιγόνο)→ Μη ανταγωνιστική μέθοδος (ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το αντίσωμα - τεχνική «sandwich»)
¬Σύντομη ορολογία που θα χρησιμοποιηθεί.
Αντισώμα[1]: Είναιμια μεγάλη πρωτεΐνη σε σχήμα Υ και χρησιμοποιείται από το ανοσοποιητικό σύστημα για να εντοπίζει και να εξουδετερώνει ξένα αντικείμενα όπως τα βακτήρια και οι ιοί. Το αντίσωμα αναγνωρίζει ένα μοναδικό κομμάτι του εισβολέα που ονομάζεται αντιγόνο. Κάθε άκρο του «Υ» ατισώματος μπορεί να αναγνωρίσει και να συνδεθεί με ένα μέρος του εισβολέα αντιγόνου
με μοναδική ακρίβεια. Κάτι σαν τον συνδυασμό κλειδιού και κλειδαριάς.
Αντιγόνο[1]: Είναι ένα οποιοδήποτε μόριο το οποίο μπορεί να δεσμεύεται ειδικά σε ένα αντίσωμα. Το όνομά του προκύπτει από την ικανότητά του να παράγει αντισώματα (όταν ένας οργανισμός αντιληφθεί την παρουσία αντιγόνου, πολλαπλασιάζεται για να το εξουδετερώσει).
Beads[2]: Πρόκειται για μαγνητικά μικροσφαιρίδια τα οποία επισημαίνονταιμε φθορίζουσες χρωστικές ουσίες, που παράγουν ένα ευρύ φάσμα χρωμάτων, και τα οποία χρησιμοποιούνται ως επιφάνεια πρόσδεσης-δέσμευσης του αντιγόνου. Τα σφαιρίδια αυτά δεν είναι ορατά με γυμνό μάτι γι’ αυτό έχουν
μαγνητικές ιδιότητες ώστε να μπορούμε να τα χειριζόμαστε.
Μultiwell plate[3]: Πρόκειται για μια επίπεδη πλάκα μικροτιτλοδότησης όπως αποκαλείται (ή αλλιώς 96άρα πλάκα-αυτή που θα χρησιμοποιήσουμε εμείς), αφού διαθέτει πολλαπλά βοθρία-πηγαδάκια-wells, τα οποία επισημαίνονται με αριθμούς σε κάθε στήλη και με γράμματα σε κάθε σειρά για να μπορούμε να ταυτοποιούμε το συγκεκριμένο δείγμα. Σε αυτά τα πηγαδάκια οι βιολόγοι τοποθετούν το δείγμα τους.
Μικροπιπέτα[4]: Η μικροπιπέτα ή αλλιώς σιφώνιο χρησιμοποιείται για την μεταφορά και μέτρηση ενός όγκου υγρού. Μπορεί να μας δώσει ακρίβεια και σταθερότητα ακόμα και σε πολύ μικρές ποσότητες υγρού, της τάξης των μl.
¬Τι στάδια περιλαμβάνει η τεχνική «sandwich» με την οποία ασχολούμαστε;
1. Προσθήκη αντισωμάτων σε μορφή μικροσφαιριδίων (beads) στο δείγμα.
2. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε από το αντίσωμα.
3. Προσθήκη δευτερεύοντος αντισώματος (δημιουργία sandwich).
4. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε από το δευτερεύον αντίσωμα.
5. Προσθήκη φθορίζουσας ουσίας (φυκοερυθρίνη).
6. Πλύση με ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού προκειμένου να απομακρυνθεί ότι δεν δεσμεύτηκε.
7. Εναπόθεση των μικροσφαιριδίων (με ότι πλέον έχει προσκολληθεί πάνω τους ) σε μια καινούργια 96άρα πλάκα προκειμένου να τοποθετηθεί σε ειδικό φασματοφωτόμετρο και να μετρηθεί η απορρόφηση του δείγματος.
Ακολουθούν δύο βίντεο στα οποία φαίνονται παραστατικά οι τεχνικές elisa:
ΠρόβλημαΣτην πραγματικότητα για να πραγματοποιηθεί η επεξεργασία δείγματος με την μέθοδο elisa, με τον κλασσικό παραδοσιακό τρόπο, χρειάζονται πολλές 96άρες πλάκες για την επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων. Ο βιολόγος θα πρέπει κάθε φορά που θέλει να εφαρμόσει elisa να αλλάζει διαρκώς πλάκες. Αυτό απαιτεί χρόνο, υπομονή και σταθερότητα από την πλευρά των βιολόγων.
¬Τι στοχεύουμε να κάνουμε εμείς με αυτό το project;
Αυτό που εμείς στοχεύουμε να κάνουμε είναι να πραγματοποιείται όλη η διαδικασία του elisa δηλαδή και τα 7 στάδια χωρίς την απαίτηση διαρκούς αλλαγής πλακών επεξεργάζοντας ταυτόχρονα πολλαπλά δείγματα. Σκοπός μας είναι να κατασκευάσουμε ένα σταθερό σύστημα (χωρίς να υπάρχουν μεγάλα περιθώρια ανοχής από πλάκα σε πλάκα) από εφτά 96άρες πλάκες (μία για κάθε στάδιο) τοποθετημένες η μία κάτω από την άλλη για να πραγματοποιείται η μέθοδος στον κατακόρυφο άξονα z. Θέλουμε δηλαδή να δημιουργήσουμε με αυτόν τον τρόπο ένα 7-όροφο σύστημα πλακών που ανά πάσα στιγμή θα μπορεί να μετατραπεί σε 7 ξεχωριστές πλάκες.
¬Λεκτική περιγραφή της διαδικασίας που θέλουμε να επιτύχουμεΣημείωση:Στην διαδικασία που θα περιγράψουμε δεν θα σταθούμε στην χρήση της πιπέτας καθότι αυτό το κομμάτι αφορά μελλοντικά σχέδιά μας όπως αναφέρεται και παρακάτω.
- Αρχικά τοποθετούμε το δείγμα μας στο well του 1ου ορόφου και προσθέτουμε τα αντισώματα σε μορφή μικροσφαιριδίων (beads).
- Αναρροφάται με την πιπέτα η παραπάνω ποσότητα, αφού πρώτα έχει γίνει η επώαση (αδειάζοντας έτσι το well) και εγκλωβίζονται σε αυτήν τα beads λόγω της μαγνητικής τους ιδιότητας. Παράλληλα η ποσότητα που αναρροφήθηκε απορρίπτεται.
- Απελευθερώνουμε τα beads στο well του 1ου ορόφου και ακολουθούμε την διαδικασία πλύσης.
- Αναρροφούμε ξανά με την πιπέτα την παραπάνω ποσότητα (beads και απορρυπαντικό υγρό), εγκλωβίζουμε σε αυτήν τα beads και απορρίπτουμε το απορρυπαντικό.
- Τρυπάμε με την ίδια πιπέτα το πάτωμα του 1ου ορόφου, κινούμενη στον κατακόρυφο άξονα (στην πιπέτα βρίσκονται ήδη εγκλωβισμένα τα μικροσφαιρίδια) ώστε να φτάσουμε στο well του 2ου ορόφου.
- Εναποθέτουμε τα μικροσφαιρίδια, προσθέτουμε τα δευτερεύοντα αντισώματα και ακολουθούμε τα υπόλοιπα βήματα με την ίδια λογική που περιγράψαμε παραπάνω.
- Τέλος αφού έχουμε τρυπήσει και το well του 6ου ορόφου απελευθερώνουμε τα μικροσφαιρίδια στο well του 7ου ορόφου. Μπορούμε πλέον να απομονώσουμε την έβδομη 96άρα πλάκα και να την τοποθετήσουμε στο Luminex, μια συσκευή που μετράει την φωτεινότητα που εκπέμπουν τα beads.
(Δεν πρέπει να ξεχνάμε ότι από την στιγμή που προσθέτουμε στο δείγμα μας τα beads το προς επεξεργασία υλικό δεν είναι πλέον το δείγμα, αλλά τα beads).Εννοείται πως όλη η παραπάνω διαδικασία αν πετύχει θα μπορεί να πραγματοποιηθεί με την βοήθεια πιπέτας πολλαπλών δειγμάτων, τοποθετώντας δείγματα και στα 96wells κάθε πλάκας.Πρώτο “Brainstorming”
Κατά την διαδικασία του πρώτου brainstorming στόχος μας ήταν να αναγνωρίσουμε τα κυριότερα προβλήματα που είχαμε να αντιμετωπίσουμε με τον σχεδιασμό της πλάκας καθώς και παρεμφερή εργαλεία (π.χ πιπέτα) που έπρεπε να χρησιμοποιηθούν. Από την διαδικασία προέκυψαν τα παρακάτω προβλήματα:
Έπειτα από συνάντηση με τους βιολόγους του εργαστηρίου καταλήξαμε στον τελικό όγκο του κάθε πηγαδιού και έτσι υπολογίσαμε και το ελάχιστο δυνατό ύψος της κάθε πλάκας (άρα και ολόκληρης της 7οροφης κατασκευής) και στην κατάλληλη επιλογή του μήκους της πιπέτας που θα πειραματιζόμασταν στο εργαστήριο. Επόμενο στάδιο του brainstorming και καθοριστικό ήταν η σχεδίαση του πατώματος του κάθε πηγαδιού το οποίο θα τρυπούσε η πιπέτα. Γνωρίζοντας ότι ο εκτυπωτής μας μπορούσε να τυπώσει ελάχιστο πάχος 100 μm, για λόγους σταθερότητας της κατασκευής, έπρεπε να επιλέξουμε κατάλληλη γεωμετρία ώστε η διάτρηση να γίνεται με τις παρακάτω ιδιότητες:
Όλα τα πατώματα είχαν κατά τον άξονα z ελάχιστο πάχος 100μm ώστε να είναι εύκολο να σπάσουν όταν τα πιέζει η πιπέττα.Μέτα από εκτύπωση στον 3d printer του εργαστηρίου ενώ ολοκληρώθηκε κανονικά η εκτύπωση τους,οι διατομές πάχους 100μm "εξαυλώθηκαν".Τότε αποφασίσαμε να αλλάξουμε το ελάχιστο πάχος από 100 σε 200μm και να επαναλάβουμε την εκτύπωση.
Μέσω της διαδικασίας προέκυψαν αρκετές ιδέες από τις οποίες κάποιες απορρίφθηκαν λόγω πολυπλοκότητας εκτύπωσης. Παρακάτω φαίνονται οι γεωμετρίες που προχώρησαν στην φάση του πειραματικού ελέγχου:
Πρώτο πείραμα
Τα επικρατέστερα σχέδια, επτά στο σύνολο, εκτυπώθηκαν σε μορφή τετράγωνης πλάκας με την γεωμετρία του πατώματος στη μέση. Επιλέξαμε να εξετάσουμε τρείς πιπέτες διαφορετικών γεωμετριών με επικρατέστερη την δεύτερη πιπέτα όπως φαίνεται στην παρακάτω φωτογραφίσ: .
Το πείραμα εκτελέστηκε χειρονακτικά τοποθετώντας την κάθε πλάκα πάνω σε μια τυποποιημένη 96άρα πλάκα και χρησιμοποιώντας τα υλικά που υπάρχουν στην φωτογραφία που επισυνάπτουμε:
Σκοπός της πλάκας ήταν να στηρίξει το πάτωμά μας, προσομοιάζοντας έτσι μία 2όροφη κατασκευή (σαν να τρυπάμε το πάτωμα του προηγούμενου ορόφου και να καταλήγουμε στο επόμενο). Έτσι θα παρατηρούσαμε και τυχόν θραύσματα που θα είχαν περισυλλεχθεί στο πηγάδι.
Ακολουθούν δύο βίντεο με τις επιτυχημένες προσπάθειες του πειράματος:
Στο τέλος του πειράματος είχαμε τις εξής παρατηρήσεις:
Ειδικότερα μετά την επιλογή του κατάλληλου πατώματος προέκυψε και η ανάγκη επιλογής τρόπου για συγκράτηση των θραυσμάτων σε κάθε διάτρηση.
Φωτογραφίες αποτελεσμάτων πρώτου πειράματος:
Δεύτερο “brainstorming”
Σε αυτή την διαδικασία στόχος μας ήταν η επίλυση του προβλήματος των θραυσμάτων που απέμεναν λόγω της διάτρησης.
Αρχικά κινηθήκαμε κατασκευαστικά. Η σκέψη μας ήταν να φτιάξουμε μια “τσουλήθρα” κάτω από κάθε αντίστοιχο πηγάδι προκειμένου να κυλούν τα θράυσματα πάνω της και να συλλέγονται σε ένα σημείο. Κάτι τέτοιο ήταν αδύνατο καθώς δεν έιχαμε την πολυτέλεια του χώρου αφού εκατέρωθεν υπήρχαν και άλλα wells.
Επικρατέστερη ιδέα υπήρξε η χρήση κολλητικής ταινίας (μονής όψεως) η οποία θα “σκέπαζε” την 96άρα πλάκα μας και θα παραλάμβανε τα θραύσματα (στο πρώτο επίπεδο προφανώς δεν υπήρχε τέτοια ανάγκη).
Δεύτερο πείραμα
Στο πείραμα που ακολούθησε χρησιμοποιήσαμε δύο τέτοιες ταινίες, η μία τοποθετημένη στο πάτωμα του πρώτου επιπέδου και η δεύτερη στο χείλος του επόμενου επιπέδου.
Επιχειρήσαμε να τρυπήσουμε την ταινία αλλά αυτή ξεκολούσε. Παρόλα αυτά βγάλαμε το συμπέρασμα ότι η ταινία μπορούσε να συγκρατήσει τα θραύσματα.
Βίντεο δεύτερου πειράματος:
Έτσι καταλήξαμε στην τελική ιδέα της κολλητικής ταινίας διπλής όψεως την οποία θα τοποθετούσαμε στο χείλος κάθε πλάκας (πλην της πρώτης όπως προαναφέραμε). Με αυτό τον τρόπο θα καταφέρναμε δύο πράγματα, την σωστή εφαρμογή στην πλάκα (ώστε να μην ξεκολλάει) και την συγκράτηση των θραυσμάτων.
Από όλες τις παραπάνω διαδικασίες καταλήξαμε στα παρακάτω για κάθε μεμονωμένη πλάκα, για την ολοκληρωμένη 7όροφη κατασκευή καθώς και για την 7όροφη κατασκευή με ένα well που θα χρησιμοποιούσαμε στο τελικό πείραμα.
Design:
Μελλοντικά σχέδια
Για περαιτέρω ανάπτυξη της διάταξης μας κρίνεται χρήσιμη η ανάπτυξη των παρακάτων ιδεών:
Πηγές:
[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27155/
[2] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9417787
[3] http://corporeality.net/category/medical-scientific-instruments/
[4] http://faculty.ksu.edu.sa/moncef/Pages/OperatingtheMicropipette.aspx
[5] http://www.mercodia.se/learning-center/mercodia-elisa-technology/principle-of-technology.html
Παρουσίαση μαθήματος: